La síntesis de FTC-α se realizó siguiendo los lineamientos propuestos por [22] , en los cuales básicamente, se emplean los reactivos hidrógeno fosfato de calcio (CaHPO₄) marca Alfa Aesar y carbonato de calcio (CaCO₃) marca Merck los cuales se mezclan a una relación molar 2:1, se introducen en un crisol de platino y se calienta en un horno hasta los 1400 °C para promover la Reacción 1. Después de un sostenimiento de dos horas a dicha temperatura, se lleva a temperatura ambiente a una velocidad de enfriamiento de 10 °C/min con el objetivo de estabilizar la fase alfa deseada a temperatura ambiente.

2CaHPO₄ + CaCO₃ → Ca₃(PO₄)₂ + CO₂ + H₂O Reacción 1

El FTC-α obtenido se lleva a molienda empleando un molino centrífugo, marca S1000 Restch durante 15 minutos a 500 RPM para finalmente tamizar, empleando un tamiz malla #500 de la serie Tyler, a fin de obtener partículas menores a 25 μm.

La síntesis de HAC-B se realiza por el método de precipitación en medio húmedo. Inicialmente se disuelve nitrato de calcio (Ca(NO₃)₂) en agua desionizada con agitación magnética constante en un vaso reactor. Una vez disuelto el reactivo, se hace el cierre del reactor y alrededor del mismo se dispone un baño de aceite a una temperatura de 95 °C con agitación constante y flujo de argón como gas inerte para evitar la carbonatación de las apatitas precipitadas debido al gas carbónico de la atmósfera. Obtenida la temperatura deseada, se adiciona, a una velocidad de 10 mL/min con ayuda de una bomba peristáltica, una solución de bicarbonato de amonio (NH₄)HCO₃ y fosfato diamónico (NH₄)₂HPO₄ hasta agotar totalmente la solución para comenzar el tiempo de maduración donde se conservan las condiciones de temperatura, agitación e ingreso de argón durante 30 min para finalmente, separar el sobrenadante, realizar el lavado del precipitado con agua desionizada, filtrar el producto obtenido y dejar secar durante doce horas a 80 °C en una estufa de secado [23]–[2 5].

El Poloxámero 407 se adquirió comercialmente como reactivo químico con el nombre de Pluronic® F-127 de la marca Sigma Aldrich, el cual se encuentra en forma de escamas con un peso molecular de ~12600 g/mol. Las soluciones se obtuvieron a partir de la disolución de las escamas sólidas del Pluronic® F-127 en agua desionizada en concentraciones de 20 % y 40% en peso debido a la insolubilidad que presenta por debajo de este rango. Para la preparación de dichas disoluciones se empleó una plancha de agitación magnética y un baño de hielo para favorecer la disolución del polímero [26].

Los resultados FRX de los polvos de FTC-α y de HAC-B se presentan en la Tabla 1. La relación Ca/P obtenida fue de 1,47 para el FTC-α y de 1,73 para la HAC-B, que corrobora la correcta síntesis de estos reactivos al compararlos con lo reportado por otros autores donde presentan valores de Ca/P de 1,5 y 1,67 respectivamente [11]. El aumento en la relación Ca/P de la HAC-B en comparación con la HA estequiométrica, se debe a la sustitución del ion fosfato por el ion carbonato, ocasionando una disminución en la cantidad de P [8],[11],[22],[31].

Tabla 1 . Tabla 1 . Contenido de Ca y P elemental en porcentaje en peso y moles; relación Ca/P de los polvos precursores

	% peso		Moles
	Ca	P	Ca	P	Relación molar Ca/P
FTC-α	37,58	19,77	0,93	0,63	1,47
HAC-B	41,15	18,47	1,02	0,59	1,73

Fuente: elaboración propia.

La Figura 1 muestra los espectros FTIR de las muestras FTC-α e HAC-B obtenidas. Finalizado el proceso de síntesis, se corrobora la transformación y estabilización de la fase α del FTC a temperatura ambiente por la presencia de los modos de vibración característicos del ion PO₄ ^3- presentados a continuación (Figura 1a), la banda más amplia correspondiente a los números de onda 1058, 1013 y 984 cm^-1 indican el estiramiento antisimétrico (ν₃) del enlace P-O; a 954 cm^-1 se presenta el estiramiento simétrico (ν₁) del enlace P-O; en los números de onda 558 y 580 cm^-1 se encuentra la flexión antisimétrica (ν₄) del enlace P-O; y finalmente, a 444 cm^-1, se presenta el balanceo simétrico (ν₂) del enlace P-O [22],[3 2].

Figura 1. Figura 1. Espectro infrarrojo. FTC-α (a), HAC-B (b) Fuente: elaboración propia.

En cuanto a la HAC-B se observan, según la Figura 1b, los picos con mayor intensidad identificados en los números de onda 1024 y 960 cm^-1 que corresponden al estiramiento asimétrico (ν₃) del ion PO₄ ^3-, las bandas a 502 y 564 cm^-1 son indicativas del estiramiento simétrico (ν₄₎ del ion PO₄ ^3- y el pico correspondiente al número de onda 3572 cm^-1 se atribuye al estiramiento (ν_s) del ion OH^- representativo en la hidroxiapatita. Se corroboró la sustitución iónica esperada para la HAC-B representada en los picos ubicados en 1450-1414 (ν₃) y 874 (ν₂) cm^-1 atribuidos a la vibración de estiramiento antisimétrica del enlace C-O presente en el ion (CO₃ ^2-) [33],[34].

En la Figura 2a-b se muestran las imágenes MEB obtenidas para los polvos de FTC-α (Figura 2a) y HAC-B (Figura 2b). Para el FTC-α se aprecia una amplia distribución de tamaños de partícula con geometría irregular y bordes redondeados logrado por el proceso de molienda al que fue sometido; de igual forma se puede apreciar aglomeración entre partículas lo que puede atribuirse a humedad presente. Para la HAC-B se puede apreciar el tamaño submicrométrico que se obtiene por la ruta de procesamiento utilizada y la aglomeración de las partículas atribuida a su tamaño e higroscopicidad.

Figura 2. Figura 2. Imágenes MEB a) FTC-α, b) HAC-B, y DRX de c) FTC-α, d) HAC-B Fuente: elaboración propia.

Se presenta en la Figura 2c-d el DRX de los precursores FTC-α (Figura 2c) y HAC-B (Figura 2d). Se tiene que los picos corresponden principalmente a la estabilización de FTC-α a temperatura ambiente obtenida gracias al tratamiento térmico y que, de igual forma, hay presencia poco representativa de fase β en la muestra [14],[22]. El difractograma de rayos X para la muestra de HAC-B evidenció la presencia de hidroxiapatita por la correspondencia de los picos y la baja cristalinidad que presenta debido a la distorsión de los parámetros de red de la hidroxiapatita a causa de la sustitución iónica del ion PO₄ ^3- por el ion CO₃ ^2- [34].

El espectro IR del Poloxámero 407 se muestra en la Figura 3a donde se destacan los picos característicos presentes a 2972 y 2880 cm^-1 atribuidos a los grupos funcionales CH₃ y CH₂, respectivamente; a 1466 cm^-1 se encuentra presente la flexión del grupo funcional CH; a 1346 cm^-1 se presenta el aleteo del grupo funcional CH₂ con la flexión de estiramiento del enlace C-C; también se puede ver el balanceo del grupo funcional CH₂ a 1240 cm^-1. Las vibraciones de estiramiento a 1100 y 960 cm^-1 están atribuidas a los enlaces C-O y C-O-C, respectivamente; y finalmente, a 840 cm^-1, se presenta el balanceo del grupo funcional CH₂ [3 5],[36].

Figura 3. Figura 3. a) FTIR, b) DRX del Poloxámero 407 Fuente: elaboración propia.

Debido a que el Poloxámero 407 es un polímero semicristalino compuesto por fases cristalinas de polióxido de etileno (PEO) y fases amorfas de polióxido de propileno (PPO,) en la Figura 3b se muestra el patrón de difracción de rayos X que confirma su carácter semicristalino. Los dos picos de mayor intensidad a 19° y 23° corresponden a los planos (110) y (200) de la fase cristalina del polímero [37],[38]. Los demás picos presentes de más baja intensidad se pueden atribuir a la presencia de impurezas relacionadas con algunos residuos del bloque PEO-PPO [39].

La relación molar Ca/P obtenida para cada tinta se muestra en la Tabla 2. Las tintas evaluadas poseen una relación Ca/P similar a la relación que se tiene para la HADC presente en la fase mineral del hueso, la cual se encuentra en un rango de 1,5-1,67, lo que puede significar una buena biocompatibilidad entre el implante y el tejido [8],[40]. Se identifica que la adición del polímero no genera un aumento considerable en la relación molar Ca/P final, ya que este compuesto orgánico no aporta iones Ca o P en la formulación dada su naturaleza orgánica. Sin embargo, el ligero aumento identificado en los cementos obtenidos con el poloxámero puede deberse a que la hidroxiapatita obtenida en el cemento es ligeramente más ordenada, fenómeno atribuido a que la fase acuosa generada por el polímero disminuye la cinética de precipitación de la HA [41].

Tabla 2. Tabla 2. Contenido de Ca y P en porcentaje en peso y moles; relación Ca/P de los CFC obtenidos

	% peso		moles
	Ca	P	Ca	P	Relación Molar Ca/P
CFC- 0 % F-127	35,53	18,94	0,88	0,61	1,45
CFC- 20 % F-127	32,19	16,13	0,80	0,52	1,55
CFC- 40 % F-127	29,32	14,62	0,73	0,47	1,55

Fuente: elaboración propia.

En la Figura 4 se presentan los espectros IR del Poloxámero 407 y las tintas después del proceso de fraguado. Los espectros de las tintas son aproximadamente idénticos lo que indica que la presencia de Poloxámero 407 e HAC-B dentro de los compuestos no interfieren en la precipitación de la fase HA deseada, ya que, a pesar de que no se tiene un análisis cuantitativo, en las tres tintas se presentan los picos característicos de dicha fase y estos se repiten aproximadamente al mismo número de onda en las tres tintas, lo que cualitativamente muestra una similitud entre las muestras. Se evidencia la formación de HA debido a los modos de vibración característicos en los números de onda enunciados a continuación: para el ion PO₄ ^3- se presentan ν₁ a 960 cm^-1, ν₂ a 474 cm^-1, ν₃ a 1098-1024 cm^-1 y ν₄ a 560-600 cm^-1, donde los modos de vibración en números de onda de 960 cm^-1 y 1098-1024 cm^-1 se atribuyen al estiramiento simétrico y asimétrico del enlace P-O, respectivamente, y los modos de vibración en los números de onda 474 cm^-1 y 560-600 cm^-1 son asignados a la flexión del enlace O-P-O de ion fosfato. Por otro lado, los picos del grupo hidroxilo (OH^-) de la HA se encuentran en los números de onda de 3570 cm^-1, correspondiente al estiramiento ν_s y a 636 cm^-1, correspondiente al modo ν_L; finalmente, a 864 cm^-1 se muestra el modo de estiramiento P-O(H), correspondiente al grupo hidrogenofosfato, indicativo de la deficiencia de calcio de la HADC lo que se corroborará con los resultados de DRX y MEB [4].

Figura 4. Figura 4. Espectro infrarrojo de las tintas y el Poloxámero 407 Fuente: elaboración propia.

En la Figura 5 se presentan los difractogramas de las tres tintas. En la Figura 5a se corrobora la formación de HADC debido a los picos de mayor intensidad a 25,99°, 31,78°, 32,24°, 32,87° y 34,09° con algunos remanentes de FTC-β [42]. Adicionalmente, se hizo un análisis detallado en el rango de 18° a 20°, alrededor de los picos característicos del Poloxámero 407 con el objetivo de presenciar algún remanente del polímero finalizado el proceso de fraguado. Según la Figura 5b, se evidencia que no existe presencia de polímero para ninguna de las tintas evaluadas y que el pico más próximo a los 23° corresponde a la HADC precipitada. La no presencia de remanentes de Poloxámero 407 finalizado el proceso de fraguado se atribuye a la lixiviación progresiva del polímero en el medio de fraguado debido a su naturaleza anfifílica [14]. Aunque el Poloxámero no es tóxico y está aprobado por la FDA [17], es conveniente que este no se encuentre en la estructura para que no interfiera en el comportamiento del CFC con las células y su función se centre en permitir que el cemento sea inyectable [43].

Figura 5. Figura 5. DRX. a) Tintas evaluadas, b) Comparativo de las tintas con el Poloxámero 407 Fuente: elaboración propia.

La Figura 6 presenta las imágenes MEB tomadas a la superficie de fractura de las probetas cilíndricas de las tres tintas después del ensayo de compresión axial. Se evidencia la morfología en forma de placas característica de la HADC precipitada debido a la hidrólisis completa del α-FTC (recuadros rojos), además, a bajos aumentos se puede observar una superficie irregular con algunos vacíos debido al proceso de moldeo manual o a la disolución de algunos aglomerados del polímero, lo que puede permitir el anclaje de células formadoras de hueso favoreciendo la bioactividad del injerto (recuadros amarillos) [29],[40]. También cabe señalar que a mayores aumentos los cristales se muestran entrecruzados, lo que favorece mecánicamente el comportamiento de los cementos obtenidos y que, finalmente, la incorporación de Poloxámero 407 en las tintas no impide la correcta precipitación de la fase HADC [16].

Figura 6. Figura 6. Imágenes MEB correspondientes a la morfología obtenida para las tintas finalizado el proceso de fraguado. Recuadros rojos: morfología de la HADC, Recuadros amarillos: porosidad Fuente: elaboración propia.

En la Figura 7 se presentan dos curvas para cada gráfica; la curva punteada pertenece a los datos experimentales los cuales se graficaron empleando (2), mientras que la línea continua se calculó y graficó haciendo uso de (3) para la probabilidad de Weibull. También en la Tabla 3 se compilan los parámetros de Weibull y el esfuerzo característico para las probabilidades de falla del 20 %, 50 % y 90 % de las muestras evaluadas. El esfuerzo característico y el esfuerzo a las probabilidades de falla de 20 %, 50 % y 90 % disminuyen con la adición de Poloxámero 407, lo que posiblemente se deba a una mayor porosidad en las tintas CFC- 20 % F-127 y CFC- 40 % F-127, que puede generarse por la disolución de las micelas del polímero durante el proceso de fraguado. De igual forma, tomando como referencia el esfuerzo al cual fallan el 90 % de las muestras, se puede decir que los cementos obtenidos podrían ser empleados como injerto óseo en zonas de hueso trabecular donde se soportan esfuerzos de compresión aproximados entre 2-10 MPa [44].

Figura 7. Figura 7. Distribuciones de Weibull de compresión de las tintas a) CFC- 0 % F-127, b) CFC- 20 % F-127 y c) CFC- 40 % F-127. Cuadros: valores experimentales (Ecuación 1). Línea roja: Pf calculado utilizando el módulo de Weibull y los valores de esfuerzo característicos de la Tabla 3 Fuente: elaboración propia.

Tabla 3. Tabla 3. Parámetros de las distribuciones de Weibull, esfuerzo característico (σ0), módulo de Weibull (m) y probabilidad de falla del 20 %, 50 % y 90 % para cada tinta

Tinta	σ0 (MPa)	M	Pf-20 %	Pf-50 %	Pf-90 %
CFC- 0 % F-127	12,67	9,87	10,89	12,17	13,80
CFC- 20 % F-127	5,55	6,00	4,36	5,27	6,58
CFC- 40 % F-127	3,64	10,65	3,21	3,52	3,97

Fuente: elaboración propia.

En este tipo de cementos, la cristalinidad, el tamaño de grano, el área superficial específica y el contenido de porosidad, son factores influyentes en su comportamiento ante la degradación en condiciones fisiológicas, es por esto que determinar la porosidad y densidad aparente puede dar un indicio del comportamiento, no solo a la degradación, sino también a las propiedades mecánicas finales de este [30]. En la Figura 8 se ve que la tinta CFC- 0 % F-127 posee una densidad y porosidad aparente de (1,3 ± 0,1) g/cm³ y (57,1 ± 0,6) %, respectivamente, en comparación con los valores (0,7 ± 0,0) g/cm³ y (69,3 ± 0,4) % de CFC- 20 % F-127 y (0,6 ± 0,0) g/cm³ y (72,0 ± 0,8) % de CFC- 40 % F-127. Lo que indica que la presencia de Poloxámero 407 con mayor concentración influye significativamente en la porosidad de las muestras y, por ende, en la densidad debido a la relación inversamente proporcional que estas dos variables tienen, lo cual, a su vez, corrobora los resultados obtenidos en la resistencia máxima a la compresión.

Figura 8. Figura 8. Densidad y porosidad aparente de las tintas evaluadas finalizado el proceso de fraguado Fuente: elaboración propia.

En las micrografías MEB de la Figura 9 se presenta la morfología de la superficie de las tres tintas después del proceso de degradación acelerada durante ocho horas en el medio ácido, el cual simuló, en condiciones fisiológicas aceleradas (37 °C, 100 RPM y pH 2,0), la degradación por osteoclastos durante el proceso de regeneración ósea. Se puede observar que, en comparación con las imágenes MEB obtenidas en la Figura 6, a bajos aumentos, la superficie de las muestras presentan menor irregularidad y, de igual forma, a mayores aumentos, se puede observar una degradación de los cristales de HADC a causa del medio ácido, notándose una disolución de las placas de HADC [30]. La degradación de los cristales de HADC es más notoria para las tintas CFC- 20 % F-127 y CFC- 40 % F-127 lo que puede atribuirse a una mayor presencia de porosidad aparente permitiendo mayor área expuesta para la degradación [12].

Figura 9. Figura 9. Micrografías MEB luego del ensayo de degradación acelerada Fuente: elaboración propia.

La Figura 10 presenta la pérdida en peso calculada después del proceso de degradación, lo cual corrobora lo observado en las micrografías de la Figura 9 donde la presencia de Poloxámero 407 influye notoriamente en el proceso de degradación debido a la presencia de mayor área expuesta para la degradación. La masa perdida de las tintas con polímero es más del doble de la tinta CFC- 0 % F-127, dada la posible presencia de mayor porosidad y menor densidad causada por el espaciamiento entre partículas producto de la formación micelar del polímero, corroborado en los resultados de la Figura 8 [14]. Sin embargo, el porcentaje de masa perdida entre las tintas CFC- 20 % F-127 y CFC- 40 % F-127 se considera igual, indicando que la mayor adición de polímero no es influyente en la degradación de tintas preparadas con el Poloxámero 407.

Figura 10. Figura 10. Porcentaje de masa perdida de las tintas luego del ensayo de degradación acelerada Fuente: elaboración propia.